De to foregående eksempler, hvor det ene involverede et prøveresultat uden for metodens måleområde og hvor det andet involverede fremstilling af et sæt standardopløsninger, viser to af de mest almindelige årsager til at udføre fortyndinger i det kliniske laboratorie. Men nogle særlige tilfælde, kræver fortynding i flere trin, i stedet for de enkelte trin anvendt i de tidligere eksempler.

Tag for eksempel det tilfælde, hvor en procedure kræver en 1:8000 fortynding. Udførelse af en så stor fortynding i et trin, er upraktisk for så vidt at den kræver en slutbeholder der kan rumme det store slutvolumen og fordi en beholder indeholdende 8 L af en vandig opløsning, nemt kan komme op og veje mere end 10 kg. Dertil kommer, at hvis beholderen er af glas, skaber kombinationen af vægt og glassets forholdsvise nemme ødelæggelse, unødige risici for teknikeren.

For at omgå dette problem, udføres fortyndingsrækker, der er en række af små fortyndinger, der i sidste ende giver det samme målforhold på 1:8000. Figur 1 afbilder proceduren. I dette eksempel, udføres først en fortynding på 1:20 af den oprindelige opløsning, der i dette eksempel har en koncentration på 200 mM; overfør 1 mL af denne prøve til et andet reagensgals (A) og fortynd det til 20 mL. Den resulterende koncentration er 10 mM. Derefter foretages en 1:20 fortynding af opløsning A, ved at overføre 1 mL til et andet reagensglas (B) og fortynde det til 20 mL. Den resulterende koncentration er 0,50 mM. Opløsning B er 20 gange mindre koncentreret end opløsning A, der igen er 20 gange mindre koncentreret end den oprindelige prøve. Derfor er opløsning B 400 gange mindre koncentreret end den oprindelige prøve.

Til sidst udføres en 1:20 fortynding af opløsning B ved at overføre 1 mL til et andet reagensgals (C) og fortynde til 20 mL. Koncentrationen i opløsning C, er nu kun 0,025 mM og opløsning C er nu en 1:8000 fortynding af den oprindelige opløsning.

Figur 1:

En fortyngingsrække

Som figur 1 viser, er hver af opløsningerne A, B og C, 20 gange mindre koncentreret end den foregående opløsning; det vil sige at fortyndingsfaktoren for hvert rør er 20 gange højere, end i det foregående rør. Det tilsvarende fortyndingsforhold, er rørfortyndingen (reagensglasfortyndingen), der normalt er konstant fra det ene rør til det næste og som kan beregnes ud fra denne ligning:

Hvor D_rør er rørfortyndingen, V_prøve er prøvens volumen og V_fortynder er fortyndingsmidlets volumen. Imidlertid er fortyndingsforholdet i hvert rør, relativ til udgangsopløsningen og er prøvefortyndingen og det afspejler hvor meget den oprindelige prøve er blevet fortyndet op på dette punkt i fortyndingsrækken. Fordi rørfortyndingen er den samme for alle rør, danner prøvefortyndingen en geometrisk serie, som i dette eksempel er 1/20, 1/400, 1/8000, eller 1/20¹, 1/20² og 1/20³. Således kan vi beregne prøvefortyndingen i et givent rør ud fra følgende ligning:

Hvor N er nummeret på røret i sekvensen. For rør C i figur 4.2.1, som er det tredje rør indeholdende en fortynding af den oprindelige prøve, er prøvefortyndingen (1/20)³, eller 1/8000; koncentrationen af prøven i rør C er altså 1/8000 af den oprindelige prøvekoncentration.

På dette punkt, er det vigtigt at forstå forskellen mellem fortyndingsforholdet og fortyndingsfaktoren. Ligningen for fortyndingsforholdet, er forholdet mellem koncentrationen af en given fortynding (den endelige fortynding) i forhold til koncentrationen af den oprindelige prøve (den oprindelige koncentration). I figur 4.2.1, er koncentrationen af opløsning B 1/400-del af den oprindelige prøve, hvilket gør fortyndingsforholdet til 1:400. Derfor er fortyndingsfaktoren 400, den reciprokke værdi af fortyndingsforholdet; dette er det tal hvormed vi ganger koncentrationen af opløsning B for at få koncentrationen i den oprindelige prøve.

Ligningen der giver ”D_rør”, giver mulighed for hurtig beregning af en prøvefortynding. For eksempel hvis der er 10 rør i serien og hvis fortyndingen er 1/4, så er prøvefortyndingen i rør nummer 6 lig med (1/4)⁶ eller 1/4096. Brugbarheden af denne ligning går dog endnu længere.

Antag, at en tekniker skal teste modtageligheden for en bakteriel stamme over for forskellige antibiotika og teknikeren fra vejleder, får udleveret en bakteriel suspension med en koncentration på cirka 6,0 • 10⁷ bakterieceller/mL. For at kunne inokulere agarpladerne med bakterierne, har teknikeren brug for en suspension af celler i en koncentration på mellem 50 og 100 celler per mL. Derfor skal teknikeren opnå en fortynding af den oprindelige prøve på mellem 600.000 og 1.200.000 gange, der er en meget stor faktor som kræver en fortyndingsrække.

Ved at anvende D_rør ligningen, fastsætter teknikeren værdien af D_prøve til 600.000. Efter at have valgt en passende bekvem rørfortynding, for eksempel 1:10 – beregner teknikeren antallet af rør i fortyndingsrækkefølgen der er nødvendig, for at bringe antallet af bakterieceller ned i målområdet ved substitution i ligningen:

Algebraisk manipulation af denne ligning giver:

Fordi 5,8 er tæt på 6, betyder dette resultat, at hvis teknikeren udfører seks fortyndinger i en fortyndingsrække med en 1:10 rørfortynding, bør det sidste rør indeholde en prøvefortynding inden for målområdet på 1/600.000 til 1/1.200.000. Teknikeren bekræfter denne forventning ved at erstatte variablerne D_rør med 1/10 og N med 6, der rent faktisk giver en D_prøve på 1/1.000.000.

Serologi anvender også teknikken med fortyndingsrækker i kvantificering af antistoftitere. Et antistoftiter, repræsenterer mængden af et antistof, der er til stede i serum mod et bestemt antigen og er defineret som den reciprokke værdi af den højeste prøvefortyndingsfaktor, ved hvilken antistoffet er detekterbart. Denne teknik bruges til at screene patienter for eksponering for et patogen eller til at evaluere en vaccine.

Kort fortalt, er proceduren til fremstilling af en fortyndingsrækkefølge med rørfortynding, sædvanligvis med et forhold på 1:2, hvilket giver prøvefortyndinger på 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 og så videre. Derefter tilsættes antigenet som et fast volumen til hver fortynding og tilstedeværelsen eller fraværet af en reaktion noteres. Hvis for eksempel der er reaktion i hver fortynding fra 1:2 til 1:32, siges antistoftiteren at være ”32”, som er den reciprokke værdi af den højeste fortynding, hvor der var en reaktion. Det betyder, at der var nok antistof i serum til at reagere synligt med antigenet, når det blev fortyndet 32 gange, men der var ikke nok til at reagere, når det var fortyndet 64 gange eller mere.

Titeren går op, med koncentrationen af antistof i serum, fordi fortyndingsfaktoren nødvendig for at frembringe en negativ antistofreaktion, stiger. Med andre ord, indikerer en titer på 128 en større koncentration af antistof, end en titer på 16, fordi en negativ reaktion krævede en 8 gange større fortynding.