Blandt de vigtigste teknikker i det kliniske laboratorie, er analytisk spektroskopi. Den er baseret på det fænomen, at mange kemiske stoffer absorberer lys med en bestemt bølgelængde. En lysstråle med kendt intensitet (I₀) rettes mod en opløsning og intensiteten (I) af lyset der kommer ud gennem opløsningen måles derefter.

Brøkdelen af lys transmitteret (I/I₀), kaldes transmittansen (T):

Ved at være en brøkdel, spænder værdien af T mellem 0 og 1. Lyset der ikke passerede gennem prøven, blev absorberet. For eksempel, hvis T = 0,80, var blev 80% af lyset der passerede gennem prøven transmitteret og 20% absorberet. Selvom transmittansen falder, som koncentrationen stiger, er forholdet ikke lineært (se figur 1A).

Derfor er en afbildning af T mod koncentrationen, vanskeligere at bruge som en standardkurve end en lige linje. Men logaritmen til T som funktion af koncentrationen, er en lige linje og er som følge heraf mere nyttig til dette formål (se figur 1B). Følgelig er absorbansen (A) defineret som logaritmen (base 10) af transmittansen:

Absorbans afhænger, logisk nok, af følgende tre faktorer:

• Koncentrationen af det absorberende kemiske stof (kromoforen). Ved højere koncentrationer er der mere af kromoforen til stede som kan absorbere lys.
• Længden lyset skal rejse for at passere gennem opløsningen. I en længere beholder, forbliver lyset i kontakt med kromoforen i en længere periode og har dermed større mulighed for at blive absorberet.
• Den naturlige evne kromoforen har til at absorbere lys. Denne evne er kvantificeret i den molære absorptionskoefficient, eller den molære ekstinktionskoefficient. For hver kromofor, er den unik under et bestemt sæt betingelser (opløsningsmiddel, bølgelængde, temperatur med videre)

Beer-Lamberts lov (også kaldet ”Beer’s lov), er det matematiske forhold mellem absorbans og de tre faktorer anført herover:

LIGNING 3A

Ligning 3A er lineær. Som figur 1B viser, er absorbansen direkte proportional med koncentrationen (som den er til lysets rejseafstand), med  som proportionalitetskonstant.

Figur 1:

Forhold mellem transmittans og koncentration er ikke-lineær;
%T er ikke proportional med koncentrationen. B: Absorbans
er direkte proportional med koncentrationen.

Hvis A er blevet målt og hvis den molære absorptionskoefficient og lysets tilbagelagte vej er kendt, så kan koncentrationen af en kromofor beregnes ved at løse ligning 3A, gældende for c:

Lad os for eksempel antage, at vi har en opløsning af vitamin A i isopropylalkohol og vi ønsker at fastslå dets koncentration. I en opslagsbog finder vi, at vitamin A i isopropylalkohol, har en molær absorptionskoefficient på 52,300 L x mol^-1 x cm^-1. Hvis vi måler absorbansen af vores opløsning til at være 0,628 og hvis afstanden lyset skal tilbagelægge er 1 cm, så er koncentrationen:

Beer’s lov, er især nyttig når analytten er for ustabil til at generere en standardkurve over absorbans i forhold til koncentrationen. I et sådant tilfælde, beregner vi koncentrationen direkte fra dens absorbans i opløsningen. Dette er den molære absorptionskoefficients metode.

Et alternativ til molær absorptionskoefficientmetoden er enkelt-standardmetoden, ved hvilke absorbansen af kun én standardopløsning måles og en linje trækkes gennem resultatpunktet som standardkurven. Denne metode er nyttig, hvis vi ved at standardkurven er lineær.

Selvom absorbansen er direkte proportional med koncentrationen, forbliver forholdet ikke lineær som koncentrationen stiger (se figur 2). For enhver kromofor, skal det koncentrationsområde hvor absorbansen er lineær, bestemmes eksperimentelt og enhver absorbans aflæst over dette område, bør ikke tillægges nogen tillid, hvis det anvendes i Beer’s lov.

Figur 2:

Forholdet mellem absorbans (A) og koncentration,
bliver til sidst ikke-lineært.

Nogle gange, følger et kemisk stof ikke Beer’s lov ved enhver koncentration og giver i stedet en kurve over hele området.

Derfor, har fremstilling af en standardkurve ud fra flere datapunkter, mindst to store fordele i forhold til enkelt-standardmetoden.

• Den kan afsløre ikke-linearitet der kan være til stede, således at (1) prøven kan fortyndes til det lineære område, eller (2) dataene kan være egnet til at tilpasse kurven ved hjælp af ikke-lineær regression.
• Den udligner tilfældige fejl, hen over alle standarderne.

Men den ekstratid og omkostningerne udfør en ulempe ved standardkurven over enkelt-standardmetoden.