Fordi få reaktioner ville gå for langsomt, til at kunne opretholde livet, katalyseres næsten alle kemiske reaktioner, der foregår i levende organismer. Næsten alle kendte biologiske katalysatorer, kaldet enzymer, er proteiner. Faktisk mente man at alle enzymer var proteiner, indtil opdagelsen af katalytiske ribonukleinsyrer i 1980’erne.

Betydningen af enzymer i det kliniske laboratorie er todelt. For det første, kan aktiviteten af et enzym i en patientprøve, give et fingerpeg mod en diagnose. Et eksempel er enzymet alaninaminotransferase ved leverskader, glucose-6-phosphat-dehydrogenase ved hæmolytisk anæmi, alkalisk phosphatase ved knoglesygdomme, amylase ved pancreatitis (kronisk betændelse i bugspytkirtlen) og aetylcholinesterase ved forgiftninger med insekticider.

For det andet, er udvalgte enzymer bevidst indarbejdet i tests som reagenser. For eksempel anvendes enzymet alkalisk phosphatase i visse tests, for at danne et fluorescerende produkt, hvis mængde er direkte proportional med koncentrationen af analytten i prøven.

Enzymer, er påfaldende effektive som katalysatorer. De kan forøge reaktionshastigheden så meget som 10²⁰ gange og er ofte mange gange mere effektive end syntetiske katalysatorer. Den kvantitative undersøgelse af enzymkatalyse, eller enzymkinetik, der er blevet udviklet over årtier, gør os i stand til at forstå, ikke blot hvordan enzymer udfører deres ekstraordinære bedrifter, men også hvordan vi kan måle deres aktivitet og udnytte dem i det kliniske laboratorie.

Reaktionshastigheder

Reaktionshastigheden, er et mål for hvor hurtigt en reaktion går (reaktionshastigheder bliver undertiden fejlagtigt beskrevet som ”hurtig” eller ”langsom”, selv om det er reaktionen i sig selv der er hurtig eller langsom, reaktionshastigheden selv er ”høj” eller ”lav”). Betragt denne simple reaktion: A → Z. I praksis, bestemmes hastigheden af en reaktion, ved hurtigt at blande reaktanterne i et rør eller anden beholder og derefter bestemme koncentrationen af enten en af reaktanterne (kaldet et ”substrat”, hvis reaktionen er enzymrelateret), eller af et produkt efter en vis tid er forløbet (se figur 1).

Figur 1:

Ændringen i koncentrationen af reaktant A
(blå kurve) og produktet Z (pink kurve), som
funktion af tiden for reaktionen A → Z

Reaktionshastigheden, er ændringen i koncentrationen af A eller Z divideret med den tilsvarende ændring i tiden:

eller

Enhederne er selvfølgelig koncentration per tid. Nogle eksempler er: ”µmol/L/sekund”, ”mg/dL/minut” og ”mEq/mL/minut”. Bemærk dog, at reaktionshastigheden ikke nødvendigvis er konstant; snarere er den kun et gennemsnit over tidsintervallet angivet.

Analysemetoder

I det kliniske laboratorie, anvendes kemiske reaktioner til at kvantificere mange analytter og en god de af disse reaktioner, anvender enzymer som reagenser. I en slutpunktsanalyse (figur 2A), måler vi absorbansen på et fast tidspunkt, hvilket kan være flere minutter eller flere timer efter reaktionen begyndte. Vi beregner derefter koncentrationen ud fra en standardkurve, lavet fra en fælles standard eller ud fra den molære absorptionskoefficient. Fra denne koncentration, kan vi så beregne reaktionshastigheden. En to-punktsanalyse (figur 2B), måler derimod absorbansen ved hver af to tidspunkter; vi kan derefter beregne reaktionshastigheden mellem dem. En kinetisk analyse (figur 2C), måler absorbansen ved flere tidspunkter og fra alle målepunkterne, kan vi så beregne reaktionshastigheden.

Af disse tre, er den kinetiske analyse den mest pålidelige, fordi den kan bekræfte linearitet mellem absorbans og tid, i hvilke tilfælde reaktionshastigheden er konstant og man kan konkludere at (a) alle reaktionsbetingelserne er de samme fra en målt absorbans til den næste og at (b) testen kun er afhængig af analytkoncentrationen. To-punktsanalyse og slutpunktsanalysen er mindre pålidelige, fordi de antager linearitet.

Figur 2:

Testmetoder. (A) slutpunktsanalyse. Absorbansen måles ved kun ét
tidspunkt efter reaktionen er startet. (B) to-punktsanalyse. Absorbansen
måles ved to forskellige tidspunkter. (C) Kinetisk analyse. Adskillige
absorbansmålinger tages ved forskellige tidspunkter.

Reaktionsfaser

En enzymkatalyseret reaktion, har typisk tre faser (se figur 3). Under lagfasen, der er den første fase og kan være i 1 eller 2 minutter, kan forskellige processer være under vejs, for eksempel stabilisering af temperatur og enzymaktivering ved cofaktorer eller coenzymer. Reaktionshastigheden stiger under denne fase, indtil den når en konstant hastighed, på hvilket tidspunkt den lineære fase begynder. I hele denne fase, er koncentrationen af produktet direkte proportional med tiden, hvilket betyder, at forholdet mellem koncentration og tid er lineær. Som tiden går, indtræder reaktionen i substratudtømningsfasen, i hvilken substratkoncentrationen er faldet så meget, at produktdannelsen bremses og danner et plateau på reaktionskurven og begynder herefter at nærme sig nul.

Figur 3:

Typiske faser i en enzymkatalyseret reaktion.
Lagfase: enzymet undergår aktivering med
cofaktorer og coenzymer i reaktionsblandingen.
Lineær fase: koncentrationen af produktet Z er
direkte proportional med tiden og reaktionshastigheden
er derfor konstant. Substratudtømmelsesfasen:
reaktionen har forløbet så længe, at substratet er
blevet forbrugt og koncentrationen af Z forøges ikke
længere (det vil sige reaktionshastigheden går tilbage til nul).

Michaelis-Menten ligningen

Som forklaret i afsnittet om lige linjer og i figur 3, er reaktionshastigheden kun konstant i den lineære fase. I denne fase, kaldes reaktionshastigheden for den initiale reaktionshastighed. Figur 4 viser ændringen i koncentrationen af Z som funktion af tiden på tre forskellige startkoncentrationer af substratet. Ikke overraskende, stiger den initiale reaktionshastighed med substratkoncentrationen ved begyndelsen af reaktionen. Hver initiale reaktionshastighed, er hældningen af dens linje, hvilket naturligvis kan beskrives ved ligningen: y = mx + b.

Figur 4:

Initial reaktionshastigheder af den
enzymkatalyserede reaktion:  ved
tre forskellige startsubstratkoncentrationer
[S]_x. Den initiale reaktionshastighed (V)
ved hver [S], er hældningen af den lineære
del (stiplet blå linje) af kurven.

Den initiale reaktionshastighed (V) kan plottes mod startsubstratkoncentrationen ([S]), hvilket giver en kurve som den i figur 5. Ved lav [S], stiger V næsten lineært med [S]. Som [S] fortsætter med at stige, begynder V dog at stige langsommere og indtræder på et niveau, hvor stigningen næsten stopper, selv om koncentrationen af [S] fortsætter med at stige. Værdien af reaktionshastigheden ved en meget høj koncentration af [S], er symboliseret som V_max. I dette område af grafen, hvor reaktionshastigheden ikke reagerer mærkbart på yderligere stigninger i koncentrationen af substratet, siges enzymet at være mættet, fordi det ikke kan binde substratet hurtigere (V_max er en asymptote, en linje som en kurve nærmer sig uden nogensinde at nå den). Værdien af [S] ved det halve af V_max, er defineret som K_M.

Figur 5:

En graf over Michaelis-Menten ligningen (ligning 3A)

I 1913, foreslog Leonor Michaelis og Maude Mentes, en model til at forklare denne adfærd. I deres model, binder enzymet substratet, udfører de nødvendige kemiske ændringer og frigiver derefter produktet; efter det sidste trin, er enzymet klar til at gentage processen. Ud fra denne model, fremkom Michaelis-Menten ligningen, der beskriver kurven i figur 5:

LIGNING 3A

Figur 5 viser os, at når [S] er meget stor, er V lig med V_max. Desuden, når V er lig med ½ V_max, er substratkoncentrationen [S], defineret som K_M. K_M afspejler affiniteten af et enzym til substratet, eller sagt på en anden måde, styrken af bindingen mellem enzym og substrat. Som affiniteten stiger, falder koncentrationen af substrat nødvendig for at bringe V til ½ V_max derfor, fordi enzymet kan bindes til det samme antal substratmolekyler, selv med færre af dem til stede. Som affiniteten falder, stiger koncentrationen af substrat nødvendig for at bringe V til 1 V_max, fordi enzymet kan bindes til det samme antal molekyler, kun når der er flere af dem til stede. Som affiniteten stiger, falder K_M således; som affiniteten falder, stiger K_M.

Ved en lav [S], er den initale reaktionshastighed tæt på linearitet. På denne del af kurven, siges reaktionsblandingen at være første orden, fordi dens initiale reaktionshastighed er direkte proportional med substratkoncentrationen. Ved en høj [S], afhænger den initiale reaktionshastighed imidlertid ikke af substratkoncentrationen. På denne del af kurven, siges reaktionsblandingen at være nulte orden, fordi dens hastighed ikke ændres ved yderligere stigninger i koncentrationen af [S].

Fysiologisk signifikans af K_M

Som figur 5 illustrerer, kan den initiale reaktionshastighed stige ved en substratkoncentration, der ligger lidt under eller lidt over K_M. Betragt dette eksempel for denne egenskab i en biokemisk reaktionsvej.

Der er to enzymer, der katalyserer phosphorylering af glucose i cellen: hexokinase og glucokinase. Deres K_M værdier er henholdsvis omkring 0,1 mmol/L og 10 mmol/L (se figur 6). Hvad dette betyder er, at som glucosekoncentrationen stiger fra cirka 4 mmol/L efter flere timers faste, til cirka 20 mmol/L efter et måltid, kan hastigheden af glucokinase-katalyserede reaktioner øges, men det kan de hexokinase-katalyserede reaktioner ikke. Dette skyldes at hexokinase allerede fungerer ved eller tæt ved dets V_max. Glucokinase er derfor det enzym, der reagerer på ændringer i koncentrationen af cirkulerende glucose. Efter et måltid, giver denne accelerering i glucosephosphorylering udslag i hurtigere glucoseoplagring i leveren, frigivelse af insulin fra bugspytkirtlen og fjernelse af overskydende glucose fra blodet.

Figur 6:

Fysiologisk signifikans af K_M, eksemplificeret ved to
enzymer, der phosphorylerer glucose. Som
glucosekoncentrationen stiger fra 4 nM efter faste, til
20 mM efter et måltid (gult område), er det kun
glucokinasereaktionshastigheden (blå kurve), der går
hurtigere. Hexokinase (pink kurve), kan ikke øge sin
reaktionshastighed, fordi det allerede arbejder ved
dets V_max. Accelerationen af den glucokinase-katalyserede
reaktion i leveren og bugspytkirtlen, fører til sidst til
fjernelse af overskydende glucose fra blodet.

Signifikans af K_M i det kliniske laboratorie

Enzymer i patientprøver, analyseres typisk ved mættede substratkoncentrationer, så V er på V_max. Dette sikrer, at kun koncentrationen af enzym i prøven, påvirker den observerede reaktionshastighed. For at opnå denne tilstand in vitro, er substratkoncentrationen fastsat til 20 til 100 gange K_M.

Lineær transformation

Fremstilling af nok datapunkter, til at tegne en præcis kurve af V mod [S] (se figur 5), er ganske vanskelig. Selv når der er nok datapunkter, er målingen af nøjagtige værdier for V_max og derefter K_M en smule farlig, fordi en visuel evaluering af en asymptote, er et spørgsmål om menneskelig vurdering.

For at omgå denne hindring, er forskellige lineære transformationer af Michaelis-Menten ligningen (ligning 3A) blevet udviklet i årenes løb. Lige linjer, er selvfølgelig både lettere at tegne og lettere at fortolke. Ikke desto mindre, har udviklingen af hurtige computere næsten gjort disse teknikker unødvendige. Faktisk er lineær transformation næsten forældet, bortset fra at (1) de viser data på en sådan måde, der gør visuel fortolkning nem og hurtig og (2) de afslører træk ved data, som kurver gør uklare.

Lineweaver-Burk afbildningen

Den mest anvendte lineære transformation af Michaelis-Menten ligningen (ligning 3B) har været:

LIGNING 3B

Denne lineære ligning, fremkommer fra en ligetil omarrangering af ligning 3A:

Ligning 3B passer til ligningen for hældning og skæringspunktet med y-aksen, y = mx + b, hvor y er 1/v og x er 1/[S]. En graf fra denne ligning, er kendt som dobbelt-reciprokke, eller Lineweaver-Burk afbildning (se figur 7). Hældningen af denne linje er K_M/V_max og skæringspunktet med Y-aksen er 1/V_max. Skæringspunktet med x-aksen er -1/K_M. Når visuel inspektion er metoden til evaluering, er det klart at det er meget nemmere at evaluerer K_M og V_max på en Lineweaver-Burk afbildning, end det er på en direkte afbildning af Michaelis-Menten ligningen.

Figur 7:

En typisk Lineweaver-Burk afbildning.

Betragt dette eksempel, der involverer hypotetiske data indsamlet på en enzymkatalyseret reaktion (tabel 1). En direkte afbildning af data, giver den forventede Michaelis-Menten kurve (se figur 8A) og en afbildning af de reciprokke data giver en lige linje (se figur 8B).

Tabel 1 – Hypotetiske data for enzymkinetik

For dataene i tabel 1, er V_max den reciprokke værdi af skæringspunktet med y-aksen på Lineweaver-Burk afbildningen (figur 8B). Fordi linjen skærer y-aksen ved 0,02 sekunder/pmol, er værdien af V_max 50 pmol/sekund:

K_M er dem negative reciprokke værdi af skæringspunktet med x. Fordi linjen skærer x ved -0,03 mL/nmol, er værdien af K_M 33 nmol/mL:

Figur 8:

Afbildning af de hypotetiske data i tabel 1. (A) Direkte afbildning af de rå data. (B) Lineweaver-Burk
afbildning af de reciprokke værdier af data.

I dette eksempel, brugte vi kun vores øjne til at vurdere værdien af V_max og K_M. Kapitel 6, beskriver strenge matematiske procedurer for tilpasning af en linje til datapunkter og til at finde den bedste ligning der beskriver denne linje.

Vores eksempel i figur 8, viser en væsentlig ulempe ved Lineweaver-Burk transformation. Fordi det afbilder de reciprokke værdier af de rå data, er afstanden ikke ensartet på tværs af de anvendte koncentrationer. Datapunkterne komprimeres ved lave værdier af 1/[S], der svarer til høje værdier af [S]. Derfor kan det være en udfordring, at trække en præcis linje gennem dem med det blotte øje, en udfordring der indebærer en mindre risiko, når gennemprøvede statistiske metoder bruges på dataene.

Der er imidlertid en anden stor ulempe ved Lineweaver-Burk transformation. Eksperimentel usikkerhed i data er ikke ensartet og er større ved lave værdier af [S], der svarer til høje værdier af 1/[S]. Vi kan så spørge, hvor signifikant kan en sådan usikkerhed være ved evaluering af V_max og K_M på en dobbelt-reciprok afbildning?

For at besvare dette spørgsmål, lad os kigge på en reaktion, hvis sande reaktionshastighed ved [S]₁ er 2,00 mM/minut. Hvis usikkerheden i målingen er ±0,10 mM/minut, så kan den fundne hyppighed være så høj som 2,10 mM/minut. Således ville den observerede værdi af 1/v være 0,48 minutter/mM, i modsætning til den sande værdi 1/v der er 0,50 minutter/mM. Forskellen er 0,50 – 0,48, eller 0,02 minutter/mM. Ved højere substratkoncentration [S]₂, hvor den sande reaktionshastighed er 10,0 mM/minut, med den samme usikkerhed i målingen, ville generere en forskel på 0,001 minutter/mM mellem de observerede og sande værdier af 1/v.

På en dobbelt-reciprok afbildning, ville disse to datapunkter derfor have usikkerheder, der afviger med en faktor 20! Selv ved brugen af ordentlige statistiske procedurer, kan man ikke med høj tillid, trække en linje gennem datapunkterne, hvis usikkerheden afviger så meget fra hinanden.

Trods ukurans og ulemper, er der mindst tre grunde til, at den arbejdende i kliniske laboratorier, komfortabelt kan konstruere og aflæse Lineweaver-Burk afbildninger: (1) de er stadig almindeligt anvendte, (2) de er til stede i overflod i ældre litteratur og som nævnt ovenfor (3) de viser data på en enestående effektiv måde.